Eigentlich hat sich Larry Daley von seinem Job als Nachtwächter in dem Naturhistorischen Museum in New York schon vor einiger Zeit verabschiedet. Zwar stattet er ab und an seinen kleinen und großen Freunden im Museum über Nacht noch einen Besuch ab, doch eigentlich ist er nun erfolgreicher Geschäftsmann, der mit außergewöhnlichen Erfindungen haufenweise Geld verdient. Als Larry eines Abends jedoch in das Museum kommt, erfährt er dort, dass all die Exponate zur Archivierung ins Smithsonian National Archiv in Washington DC verschickt werden. Er setzt Himmel und Hölle in Bewegung, kann jedoch nichts damit erreichen. Wenige Stunden nach der Verfrachtung, bekommt Larry einen Anruf von einem seiner ehemaligen Museumsstücke: Cowboy Jedadiah berichtet ihm, dass aus Versehen auch die Tafel von Ahkmenrah, die die Exponate nachts zum Leben erweckt, mit nach Washington geschickt wurde und damit nun das komplette Smithsonian in der Nacht Kopf steht. Kurz entschlossen beschließt Larry selbst nach Washington zu Reisen, um dort für Ordnung zu sorgen
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